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分子與基因醫學研究所
分子與基因醫學研究組-插圖
研究成果

肝癌之基因體醫學研究

肝癌是最易發生的惡性腫瘤,在全世界都常是主要的死因,然而其發生機轉至今尚未清楚。身處在完成人類基因圖譜解碼的所謂後基因體時代,先進的實驗技術、分析工具與大量的生物資訊資源,提供絕佳的機會了解肝癌的成因。有鑑於一般實驗室之規模與資源常無法處理龐大的數據資料,本院研究團隊長程的目標是結合國家衛生研究院與工業技術研院不同領域的專長,包括電腦、生物資訊、基因體和蛋白質體,分頭迎擊這個複雜的問題,同時解決基因微陣列數據分析上的瓶頸。首先,蒐集網路上公開的基因資料庫,建立hypothesis-driven research,自其中分析出重要的調控標的(轉錄因子),建立肝癌生成機制中轉錄因子及其下游分子間之相互關係,再以實驗的操作,包括shRNA、基因微陣列、蛋白質體分析等技術,重建肝癌細胞中各種重要分子的調控方式;最後,系統性的比較以基因微陣列及蛋白質體(differential proteomics analyses)兩種方法進行藥物ZC008抗纖維化的分析。結果發現在此二分析系統中,許多新的標的基因有相同的表現趨勢,暗示著ZC008具有抗纖維化療效。同時,此研究策略建立了網路資訊利用與實驗室技術結合的典範,並且基因微陣列及蛋白質體的數據分析將有效搜尋出新的肝癌及肝纖維化標記與治療的基因。

利用生物資訊的分析方法,以及生物晶片資料的整合,我們找到一可能在人類肝腫瘤形成與細胞週期表現有關的基因(FLJ10540),人類與小鼠的FLJ10540互補DNA(cDNA)與蛋白質之序列皆已完成解序。針對FLJ10540表現之分析,發現其mRNA在人類肝腫瘤細胞中有過度表現的現象,於人類胚胎腎臟細胞HEK293,FLJ10540 mRNA在細胞週期中有受到調控、且具過度表現,不論是在低血清環境 (low-serum)或是在軟質膠 (soft-agar)的實驗中,FLJ10540蛋白的大量表現都會促進MDCK細胞的生長,因此推測FLJ10540 在人類肝癌形成及細胞週期調控上扮演一個非常重要的角色。進一步進行FLJ10540功能之探討,將FLJ10540 mediated FLJ10540-siRNAi送入肝癌細胞株Huh7中,破壞內生性的FLJ10540基因表現,發現其會影響到肝癌細胞的生長速度,推測FLJ10540在細胞增殖中扮演了一個重要的角色;建立哺乳動物NIH3T3-FLJ10540的細胞株來探討此基因在細胞中的訊息傳遞途徑,發現文獻指出能影響細胞轉型的四類基因ERK、p38、JNK及AKT,其中只有AKT有差異,換句話說,AKT參與FLJ10540誘導細胞的轉型;利用Luciferase assay的方法,發現FLJ10540能降低細胞內NF-κB response luciferase 基因表現量。此結果亦表示FLJ10540在細胞中除促使AKT大量表現之外,也參與了細胞內NF-κB基因的調控。

基因體學已改革許多傳統生物醫學研究的模式,亦造就高速分析的新紀元與預測醫學的可能性。為了利用新的實驗策略來加速了解基因於肝纖維化所扮演的角色,我們完成藉由致肝毒藥劑引起肝纖維化的大鼠模式之微陣列基因圖譜,鑑別出256個可能的肝纖維化生物標記與治療基因,並從中進一步找出44個肝臟壞死發炎相關與62個肝纖維化相關基因。為了更進一步了解這些基因所扮演的角色與描述調控肝纖維化的訊息傳遞路徑,我們透過生物資訊建立並預測蛋白質交互作用網絡,目前小規模實驗方式驗證模擬的蛋白質交互作用已成功,下階段預計以大規模平台進行篩選。此外,建立完成肝纖維化網站 (http://140.110.17.42:8080/LF),利用 POINT (http://point.bioinformatics.tw/) 網站完成大規模平台篩選,藉由人類、大鼠、小鼠、線蟲、果蠅與酵母菌等物種成功模擬蛋白質之間交互作用。我們將與肝臟損害時相關的256 基因經由同源性基因資料庫分析比對後,共找出41個在六種中階有同源性的基因。將此群基因橫跨物種作大規模比對後,一共預測出20個共同交互作用基因。這重大的突破顯示我們將有機會與能力藉由基因微陣列資訊拆解並分析生物體中複雜蛋白質交互作用的關係。POINT網站成功的整合各個大型蛋白質交互作用資料庫之資訊,包含國際知名的蛋白質交互作用資料庫資訊,如BIND、DIP、MINT、INTACT、MIPS等。利用生物演化同源的性質,已預測出約7萬筆人類蛋白質交互作用的資訊,預測精準度已提升至10%,並提供了各物種間INTERLOG的相關資訊。

肺癌之基因體研究

肺癌一直是台灣前三大惡性腫瘤之一,在全世界也是主要的疾病之一。因其早期診斷不易,其致病機轉不甚清楚,病患的治療成效易不佳。針對此重大疾病,本組執行一系列的研究,以了解影響肺癌療效的成因。

首先,我們使用微衛星標記,調查台灣72對「非小細胞肺癌」染色體區域的配體缺失,定出36個頻繁的LOH (loss of heterozygosity )區域,此外亦定位42個最小缺失區域,其中4個最小缺失區域,與肺腺癌病人存活相關。接著我們進一步與長庚醫院合作,從事表皮生長因子受體和肺癌相關性的研究,完成手術切除肺癌組織的表皮生長因子受體基因的序列分析,發現高達39%的腫瘤,具有表皮生長因子受體的突變,其中肺腺癌的突變率高達55%,和西方人顯著不同。此外,亦針對16名已接受Gefitinib治療的肺癌病人,進行肺癌組織分析,直接證實此基因突變和Gefitinib療效的相關性。此一發現具有重要臨床意義,受到學術界廣泛重視。本研究透過尖端的基因體科技,瞭解肺癌的致病因素,作為治療的最佳依據,同時防微杜漸,甚而可以避免無謂的醫療浪費。

肺癌之基因體研究

 

功能性基因體醫學研究

細胞凋亡機制的錯亂可導致癌症或導致癌細胞對放射線和化學治療產抵抗性。過去之研究證明JNK (c-Jun N-terminal Kinase) 訊息傳導途徑在許多刺激(包括癌症預防與治療的藥物)引起的細胞凋tress-activated protein kinase, SAPK) 訊息傳導途徑對細胞生長激素、液態剪力、發炎物質、和其他環境刺激(如癌症治療的藥物)均會產生反應。JNK的活性是由其本身之磷酸化程度所控制。JNK 分子中之Thr-Pro-Tyr motif的磷酸化可被雙特異性磷酸 (dual-specificity phosphatases) 所去除,從而導致JNK之去活化(inactivation)。

MCT-1 (multiple copies in T-cell malignancy) 致癌基因首先在淋巴腺癌細胞株被發現,與正常淋巴腺組織樣本相較,MCT-1基因在癌組織中表現量明顯增加。MCT-1為21 kDa蛋白分子,主要分佈於細胞核質中,其蛋白分子序列與基因資料庫中之其它已知蛋白無明顯相似性。MCT-1氨基酸序列中包含有CDC2及MAPK磷酸化位置,及可能與RNA分子結合之區域。我們早期研究結果顯示,MCT-1在人類乳癌細胞中大量的表現,會過度激發細胞生長酵素訊息傳導途徑、破壞基因體架構穩定性,及將正常乳腺細胞轉型惡化;此外,過度活化致癌基因MCT-1增加遺傳物質病變、破壞細胞生長週期調節功能,降低抗癌蛋白p53表現量。後續將深入探索MCT-1過度活化是否增加乳腺癌細胞對生化藥劑及幅射療法抗藥性,以及MCT-1如何過度激發生長酵素活性及破壞基因體穩定性,進而導致細胞病變。並透過解析MCT-1生化特質與抗癌基因之間交互作用、鑑定出MCT-1之功能單位、檢驗各病程之乳癌病理組織樣品、建立動物實驗模式,實驗成果將闡明MCT-1功能活性與癌症形成及轉移過程之關聯性。初步的研究發現MCT-1會增加EGFR在乳癌細胞中之表現量,在藥劑破壞基因結構的情況下,MCT-1會降低p53蛋白活性及p21表現量。另一方面,進行架構各種MCT-1 殘缺蛋白將做為深入鑑定MCT-1功能單位之材料。

神經細胞外的Ab42沉積斑以及細胞內高度磷酸化的tau蛋白質聚集形成的神經纖維叢是阿茲罕默症(Alzheimer’s disease)兩個最主要的病理學特徵。在本研究中,我們發現Ab42會造成Abl激脢的活化,若阻斷Abl的活性可以阻止果蠅細胞的神經壞死現象。更進一步,我們發現Abl的活性會影響與Cdk5蛋白的結合及Cdk5激的活化。但是我們在果蠅細胞中並未發現p35會轉換成p25的現象,顯示Cdk5的活化是可以在沒有p25的存在下發生。利用果蠅遺傳的實驗,也發現abl突變會降低Ab42誘導眼睛光受器細胞的神經壞死的現象及Cdk5激的活化。因此,我們認為Abl可以磷酸化Cdk5-Y15,並進而在Ab42誘導的神經退化過程中調控Cdk5的活性。

在早期的研究,發現HURP在肝癌病患組織切片或是老鼠再生肝臟中高量表達;當此蛋白質穩定地高量表達時,細胞能夠在低血清或是無需貼附的環境下生長,顯示HURP具有促進細胞轉型的能力。為釐清HURP如何使細胞轉型,我們找到了其上游作用激-Aurora-A,一個作用於細胞分裂期的Ser/Thr激。由初步實驗結果得知Aurora-A可以在試管內或是細胞內磷酸化HURP,並在HURP末端發現有四個Aurora-A的磷酸化胺基酸;若把細胞內的Aurora-A以siRNA打掉,則細胞內HURP的磷酸化會明顯降低;把HURP末端四個被Aurora-A磷酸化的氨基酸做點突變,則HURP無法在細胞內顯出磷酸化的狀態,這些觀察都說明HURP是Aurora-A細胞內的受質。進一步分析Aurora-A磷酸化HURP的背後意義,我們著手分析HURP磷酸化突變體(HURP-4P),發現此突變體容易被分解、在細胞內無法跟其他蛋白質交互作用、以及失去使細胞轉型的能力等。

酪胺酸激受器(tyrosine kinase receptor)基因之變異及其功能的過度活化,常被認為是致癌的主因之一,近年來許多大藥廠紛紛以酪胺酸激受器作為藥靶,開發了許多高效能的抗癌藥物。我們針對高度表現EGFR及MET的子宮肉瘤細胞株SK-LMS-1,分析這兩個受體交替活化(transactivation)的現象及探討其機制,發現刺激MET活化也連帶的導致EGFR的磷酸化-受體活化的生化反應。進一步發現EGFR的磷酸化是源於MET誘發 "類EGF生長因子" 的表現,進而刺激其受體EGFR的磷酸化。此外,利用一系列的功能性測試實驗來分析EGFR transactivation 在 MET 訊息傳導及其功能之影響。以EGFR抑制劑進行分析測試,目前已完成 branching morphogenesis 的功能性測試實驗,發現EGFR的磷酸化/活化在MET誘導的細胞 branching佔有不可或缺的角色。

遺傳疾病基因體醫學研究

本院與台北榮總、陽明大學、中研院生醫所的研究團隊,首先針對3個家庭進行「缺血性股骨頭壞死」ANFH (Avascular necrosis of the femoral head) 基因之遺傳基因連鎖分析,接著利用位置尋找候選的致病基因(positional candidate cloning),排除ANFH是由3個與血液凝集有關之候選基因之突變所造成。隨後在人類第12號染色體的一個候選基因進行定序,並找出此區域中第II型膠原基因(type II collagen gene)上之兩處突變造成遺傳性之ANFH,在3個家族中,此兩處突變分別存在所有的病人,本研究成果已彙整發表於New England Journal of Medicine 2005 Jun 2;352(22):2268-70。此外,陸續收集了60個無家族病使之ANFH樣本,發現有一個促進子(promoter)之SNP與此疾病有顯著之關聯性(Lin & Tsai, unpublished)。累積遺傳性或自發性ANFH得來之結果,第12號染色體確實為此疾病之疾病基因位置。

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